Исследования Tamotsu: прием плазмалогена с пищей увеличивает содержание плазмалогена в мембранахэритроцитов у крыс

Прием плазмалогена с пищей увеличивает содержание плазмалогена в мембранах эритроцитов у крыс

Mawatari et al. Lipids in Health and Disease 2012,11:161
http://www.lipidworid.com/content/11/1/161
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/23170810/
Широ Маватари1*, Тосихико Катафучи 2, Кийотака Миаке3 и Такехико Фудзино4

* Ответственный автор: mawatari@rheology.po-jp.com
1Институт реологической функции питания, 2241 Kubara, Hisayama-chou, Kasuya-gun, Fukuoka 811-2501, Japan

Полные сведения об авторах приведены в конце статьи.
© 2012 Mawatari et al.; лицензиат BioMed Central Ltd. Настоящая статья находится в открытом доступе в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License (http://creativecommons.org/licenses/by/2.0~~HEAD=pobj), разрешающей неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии правильного цитирования оригинальной работы.

Автореферат

Введение: известно о многих заболеваниях, связанных с дефицитом плазмалогенов. Увеличение содержания или замещение плазмалогенов в тканях могло бы благотворно влиять на состояние пациентов, страдающих от таких заболеваний, однако информация о воздействии пищевых плазмалогенов на млекопитающих отсутствует.

Метод: плазмалогены были получены из куриной кожи. Очищенные плазмалогены содержали 96,4% этаноламин-плазмалогена (PlsEtn), 2,4% холин-плазмалогена (PlsCho) и 0,5% сфингомиелина (SM).

Крысам была предложена диета, содержащая 0,1% очищенных плазмалогенов (диета PlsEtn). Для определения относительного содержания фосфолипидов был использован метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), позволяющий разделять интактные плазмалогены и все другие классы фосфолипидов за один хроматографический прогон.

Результаты: следствием приема диеты PlsEtn, которую крысы Цукер, страдающие диабетом и ожирением (ZDF), получали в течение 4 недель, стало снижение уровня холестерина и фосфолипидов в плазме по сравнению с контрольной диетой.

Результаты других стандартных лабораторных анализов плазмы, в том числе на триглицерид и глюкозу, печеночная и почечная функция, уровень альбумина и масса тела не показали изменений. В группе, получавшей диету PlsEtn, относительное содержание PlsEtn эритроцитов и фосфатидилэтаноламина (PE) увеличилось, а относительное содержание фосфатидилхолина (PC) уменьшилось.

Прием диеты PlsEtn здоровыми крысами в течение 9 недель также привел к снижению уровня холестерина и фосфолипидов в плазме и вызвал увеличение относительного содержания PlsEtn в мембране эритроцитов. Результаты других стандартных лабораторных анализов плазмы и масса тела не показали изменений.

Выводы: прием пищевого PlsEtn увеличивает относительное содержание PlsEtn в мембране эритроцитов у здоровых крыс и крыс ZDF и снижает уровень холестерина и фосфолипидов в плазме. Прием пищевого PlsEtn в течение 9 недель не оказал негативного влияния на состояние здоровых крыс.

Ключевые слова: пищевой плазмалоген, крыса Цукер, страдающая диабетом и ожирением, крыса Вистар, фосфолипиды эритроцитов, фосфолипиды плазмы

Введение

Плазмалогены являются глицерофосфолипидами, для которых характерна винилэфирная связь в положении sn-1 основной цепи глицерола и эфирная связь в положении sn-2. Положение sn-1 чаще всего связано с жирными спиртами C16, С18, или С18:1, а положение sn-2, как правило, занимает полиненасыщенная жирная кислота, в частности, арахидоновая кислота (ARA) или докозагексаеновая кислота (DHA) [1-5].

Плазмалогены присутствуют почти во всех тканях млекопитающих и составляют около 18% от общего объема фосфолипидов в клеточных мембранах, причем этаноламин-плазмалогены (PlsEtn) встречаются намного чаще, чем холин-плазмалогены (PlsCho), за исключением сердечной и скелетной мышечной ткани [1-5]. Плазмалогены не только являются структурным компонентом мембраны и хранилищем вторичных посредников у млекопитающих, но и могут участвовать в процессах мембранного синтеза, переноса ионов и оттока холестерина [1-5].

Винилэфирная связь в положении sn-1 делает плазмалогены более восприимчивыми к окислительному стрессу по сравнению с соответствующими глицерофосфолипидами с эфирными связями. Поэтому плазмалогены могут также выступать в качестве антиоксидантов, защищающих клетки от окислительного стресса [1-5].

Биосинтез плазмалогенов начинается в пероксисомах, и встречающаяся у людей наследственная пероксисомная патология, ризомелическая точечная хондродисплазия (RCDP), проявляется в дефиците плазмалогенов тканей различных органов и вызывает серьезные расстройства многих тканей и органов, таких как скелет, мозг, хрусталик глаза, почки и сердце [2-5]. RCDP может быть прямым следствием дефицита плазмалогенов и указывает на важность плазмалогенов в организме человека.

В то же время, вторичный дефицит плазмалогенов наблюдается при метаболических и воспалительных заболеваниях, таких как сахарный диабет, сердечные заболевания, рак, респираторные заболевания и болезнь Альцгеймера [3,4]. Вторичный дефицит плазмалогенов может быть следствием замедления синтеза и/или ускорения распада плазмалогенов. Пополнение и/или замещение плазмалогенов могло бы принести существенную пользу пациентам, страдающим этими заболеваниями при дефиците плазмалогенов.

Недавно был выполнен анализ данных о влиянии пищевых фосфолипидов на здоровье [6], который показал, что согласно большинству исследований пищевые фосфолипиды оказывают положительное воздействие при некоторых заболеваниях без каких-либо серьезных побочных эффектов. Однако диетические плазмалогены не были упомянуты [6].

Плазмалогены были получены нами из куриной кожи. Мы предлагали диету, содержащую 0,1% очищенных плазмалогенов крысам Цукер, страдающим диабетом и ожирением (ZDF), и здоровым крысам линии Вистар. Были выполнены обычные лабораторные исследования плазмы крови (в том числе, на общее содержание фосфолипидов) и анализ фосфолипидного состава плазмы и эритроцитов.

Результаты и анализ

Очищенные плазмалогены, полученные из куриной кожи, состояли, согласно расчету по хроматографической области ВЭЖХ, из 96,4% этаноламин-плазмалогенов (PlsEtn), 2,6% холин-плазмалогенов (PlsCho), 0,5% SM и 0,7% других фосфолипидов (таблица 1, рис. 1).

Время удерживания хроматографических пиков PlsEtn и PlsCho соответствовало времени удерживания PlsEtn и PlsCho эритроцитов мембраны крысы (рис. 1). Пики исчезали после обработки соляной кислотой (НСl), что означает, что пики соответствовали плазмалогенам [7,8] (данные не показаны). Жирные кислоты PlsEtn состояли из DHA (22:6), ARA (20:4), олеиновой кислоты (18:1), миристиновой кислоты (14:0), пальмитиновой кислоты (16:0) и стеариновой кислоты (18:0) (Таблица 1), что соответствует составу обычных плазмалогенов в тканях млекопитающих [1-4].

Таблица 1 Фосфолипидный состав очищенных плазмалогенов и жирнокислотный состав PlsEtn в очищенных плазмалогенах

Очищенные плазмалогены

Рисунок 1 ВЭЖХ хроматограмма очищенного плазмалогена из куриной кожи. Время удерживания этаноламин-плазмалогенов (PlsEtn) и холин-плазмалогенов (PlsCho) соответствовало показтелям эритроцитов крысы. Другие сокращения: PE, фосфатидилэтаноламин; PC, фосфатидилхолин; SM-1 и SM-2, сфингомиелин; PS, фосфатидилсерин; PI, фосфатидилинозитол.

(Контрольная диета)
(Диета PlsEtn)

Рисунок 2 ВЭЖХ-хроматограммы фосфолипидов при контрольной диете и диете, обогащенной плазмалогенами (диета PlsEtn). Хроматограмма показывает, что плазмалогены (PlsEtn и PlsCho) действительно присутствуют в диете PlsEtn. Сокращения: см. рис. 1.

Диета PlsEtn, которую крысы ZDF получали в течение 4 недель, индуцировала повышение уровня PlsEtn и PE и снижение уровня PC в мембранах эритроцитов (таблица 4). Диета PlsEtn, которую крысы Вистар получали в течение 9 недель, также индуцировала повышение уровня PlsEtn и тенденцию к снижению PC в мембранах эритроцитов (таблица 7). В жирнокислотном составе PlsEtn + PE наблюдалось увеличение содержания ARA (20:4) и уменьшение содержания олеиновой кислоты (18:1) (таблица 8). Увеличение содержания ARA в PlsEtn мембраны эритроцитов может отражать жирнокислотный состав PlsEtn в диете (таблица 1). Эти результаты анализа мембран эритроцитов свидетельствую о том, что пищевые PlsEtn могут увеличивать относительную концентрацию PlsEtn в тканях.

Таблица 2 Изменения в холестерине и фосфолипидах плазмы у крыс ZDF после 4 недель на диете PlsEtn

Хроматограмма фосфолипидного анализа диеты PlsEtn имеет большой пик PlsEtn по сравнению с контрольной диетой. Это означает, что PlsEtn действительно содержится в диете PlsEtn (рис. 2).

Диета, содержавшая 0,1% масс. очищенных плазмалогенов (диета PlsEtn), вызвала у крыс ZDF снижение уровня фосфолипидов и холестерина в плазме в течение 4 недель (таблица 2).

Однако результаты других стандартных лабораторных исследований плазмы, в том числе на триглицерол (TG), глюкозу, аланинаминотрансферазу (ALT), аспартатаминотрансферазу (AST), азот мочевины и альбумин, не отличались (таблица 2). Между группами на разной диете также не было отмечено различий в весе тела. Фосфолипидный состав плазмы, изученный по нашему методу ВЭЖХ, имел повышенное содержание SM в группе, поучавшей диету PlsEtn (таблица 3).

Плазмалогены в плазме были обнаружены с помощью нашего метода ВЭЖХ, но были слишком малы, чтобы оценить изменения в них (таблица 3, рис. 3). Диета PlsEtn индуцировала повышение уровня PlsEtn и PE эритроцитов и снижение уровня PC эритроцитов (таблица 4).

Здоровые крысы линии Вистар были переведены на ту же диету PlsEtn на 9 недель. Диета PlsEtn вновь привела к снижению уровня фосфолипидов и холестерина в плазме, однако результаты других стандартных лабораторных анализов плазмы не изменились (таблица 5). Фосфолипидный состав плазмы не изменился (Таблица 6). В фосфолипидном составе мембран эритроцитов в группе на диете PlsEtn отмечено увеличение PlsEtn и тенденция к снижению PC (таблица 7).

Эти результаты показывают, что пищевые PlsEtn индуцируют снижение уровня холестерина и фосфолипидов в плазме как здоровых крыс, так и крыс ZDF. Известно, что пищевые фосфолипиды вызывают снижение уровня холестерина в плазме, вероятно, вследствие ингибирования кишечной абсорбции холестерина [6,9,10]. Существует информация о том, что пищевые PE, но не пищевые PC, вызывали снижение уровня фосфолипидов, холестерина и аполипопротеина A-1 в плазме крови крыс [11]. Таким образом, этаноламин-фосфолипиды, не только PlsEtn, вызывают снижения уровня фосфолипидов в плазме. Фосфолипидный состав плазмы здоровых крыс (Вистар) не изменился после 9 недель на диете PlsEtn (таблица 6).

Другие стандартные лабораторные анализы плазмы также остались без изменений (таблица 5). Вес тела также не изменился после 9 недель на диете PlsEtn (таблица 5).

Эти результаты показывают, что пищевые PlsEtn не оказали вредного воздействия для здоровых крыс несмотря на снижение уровня фосфолипидов и холестерина в плазме. Интересно отметить, что уровень триацилглицерола плазмы не изменился у крыс ZDF и крыс Вистре вследствие приема диеты PlsEtn несмотря на снижение уровня холестерина и фосфолипидов.


Большинство диетических глицерофосфолипидов могут быть гидролизованы в положении SN-2 панкреатической фосфолипазой А2 в просвете кишечника, а затем абсорбированы энтероцитами в качестве свободных жирных кислот и лизофосфолипидов [6,12].

Существует информация о присутствии плазмалоген-активной фосфолипазы А2 в эпителии тонкой кишки [13]. Поскольку плазмалогены содержат винилэфирную связь в положении sn-1 глицерина, лизофосфолипиды, полученные из пищевых плазмалогенов после переваривания фосфолипазой А2, содержат винилэфирную связь. Известно, что пищевые алкильные глицеролы всасываются из пищеварительного тракта неизменными без расщепления эфирной связи [14-18].

Однако неизвестно, всасывается ли неповрежденной винилэфирная связь пищевых фосфолипидов. Винилэфирная связь (1-0 алк-1′-энил-sn-глицерол) не тождественна эфирной связи алкильных глицеролов (1-0 алкил-sn-глицерол). Известно, что винилэфирная связь особенно чувствительна к HCl [7,8]. Сообщается об исследовании, в котором при диете, содержащей 10% фосфолипидов мозга быка, не наблюдалось деградации плазмалогенов в лабораторных условиях, имитирующих желудок и просвет тонкого кишечника, а прием 10% фосфолипидов мозга быка привел к повышению уровня плазмалогенов в плазме крови [19].

Поэтому вероятно, что лизофосфолипиды (лизоплазмалогены), содержащие винилэфирную связь, полученную из пищевого PlsEtn, всасываются неизсенными из кишечника крысы.

Таблица 3 Фосфолипидный состав плазмы у крыс ZDF после приема диеты PIsEtn в течение 4 недель


Поскольку 1-0-алкилглицерол принимает участие в биосинтезе плазмалогенов после пероксисомального этапа, сообщается о лечении наследственных пероксисомных патологий, основанном на замещении плазмалогенов, с помощью пищевых 1-0 алкилглицеролов, которое привело к повышению уровня плазмалогенов в некоторых тканях [15-18,20] ,

В работе (Wood et al.) [20,21] описывается успешный синтез предшественника алкил-диацильного плазмалогена с использованием пальмитиновой кислоты в sn-1, DHA в sn-2 и липоевой кислоты в sn-3 (PPI-1011).

Сообщается, что PPI-1011 пополнил PlsEtn культивируемых лимфоцитов пациентов c RCDP [20], а пероральное введение PPI-1011 кроликам в течение 2 недель повысило уровень DHA и DHA-содержащих PlsEtn в плазме и сетчатке глаза [21].

Прием крысами диеты PlsEtn увеличил относительное содержание PlsEtn в мембранах эритроцитов в течение 4 недель, а прием той же диеты здоровыми крысами в течение 9 недель также увеличил относительное содержание PlsEtn в эритроцитах.

Настоящее исследование показывает, что пищевой PlsEtn безопасен для здоровых крыс, несмотря на снижение уровня фосфолипидов плазмы. Пероральное введение очищенных плазмалогенов может быть более эффективным при пополнении и/или замещении плазмалогенов тканей, чем пероральное введение алкильных глицеролов или предшественника алкил-диацильных плазмалогенов (PPI-1011), потому что вводимый плазмалоген может стать источником глицерола с винилэфирными связями, этаноламина, холина и полиненасыщенных жирных кислот, таких как DHA и ARA, и все эти вещества могут быть повторно использованы в биосинтезе плазмалогенов в различных тканях.

Недавно мы сообщали, что предварительное внутрибрюшинное введение очищенного плазмалогена из мышцы куриной грудки (содержит 47,6% PlsEtn и 49,3% PlsCho) ослабляет индуцированное липополисахаридом нейровоспаление [22].

Однако пока не установлено, повышают ли пищевые плазмалогены содержание плазмалогенов в тканях мозга при дефиците плазмалогенов.

Материалы и методы

Получение очищенных плазмалогенов

Плазмалогены были получены из куриной кожи. Куриная кожа была приобретена на рынке. Большая часть жира была сперва удалена с кожи в паровой печи, затем кожа была высушена вымораживанием. Плазмалогены были получены из сублимированной кожи по ранее описанной методике [23].

Рисунок 3 Репрезентативная ВЭЖХ-хроматограмма фосфолипидов плазмы крыс Вистар. Плазмалогены (PlsEtn и PlsCho) в плазме крыс были обнаружены описанным нами методом (A), но были слишком малы, чтобы оценить изменения в плазмалогенах, несмотря на увеличение хроматографа (B). LPC, лизофосфатидилхолин; другие аббревиатуры – см. рис. 1.

Животные и диеты

Диету, содержащая 0,1% масс. очищенных плазмалогенов (диета PlsEtn), получали путем добавления очищенных плазмалогенов к контрольной диете (AIN 96). Диеты были приготовлены и поставлены компанией Oriental Yeast Co (Токио, Япония).

Все эксперименты, связанные с использованием животных, были проведены в соответствии с Руководящими принципами по уходу и использованию животных Физиологического общества Японии.

Были приложены все усилия к тому, чтобы свести к минимуму страдания животных и количество животных, использованных в экспериментах.


Все крысы были приобретены в компании KBT Oriental Co. (Тосу, префектура Сага, Япония). Двадцать самцов крысы ZDF в возрасте 4 недель получали контрольную диету в течение 10 дней и были разделены на две группы случайным образом.

Одна группа (10 крыс) получала контрольную диету в течение еще 4 недель (группа на контрольной диете), а остальные группы (10 крыс) получали диету PlsEtn (группа на диете PlsEtn) в течение 4 недель. В другом эксперименте 18 самцов крыс линии Вистар в возрасте 6 недель получали контрольную диету в течение 10 дней и были разделены на две группы.

Одна группа получала контрольную диету в течение еще 9 недель (группа на контрольной диете), а другая группа получала диету PlsEtn в течение 9 недель. Все крысы были размещены в клетках из нержавеющей стальной проволоки в комнате с кондиционером (22°C) и 12-часовым циклом света и темноты. Они имели свободный доступ к воде и питанию согласно диете.

Получение эритроцитов

Крыс лишали пищи на 14 – 16 часов и после введения в эфирный наркоз отбирали кровь в пробирку, содержащую ЭДТК, путем сердечной пункции. Плазму крови отделяли центрифугированием при 1000 g в течение 5 мин. Эритроциты получали после сбора плазмы.

После удаления лейкоцитарной пленки и небольшой части верхнего слоя эритроцитов, эритроциты промывали три раза в холодном изотоническом солевом растворе при 1000 g в течение 5 мин при 4˚С. Небольшую часть верхнего слоя удаляли при каждой промывке.

Биохимический анализ плазмы

Часть плазмы была направлена в клиническую лабораторнию (CRC Co, Осака, Япония) для проведения стандартных клинических лабораторных исследований плазмы.

В частности, фосфолипидный состав плазмы был установлен с использованием автоматизированного анализатора (Olympus AU-5200) для определения общего содержания холестерина, фосфолипидов и триацилглицерола соответствующим ферментативным способом (тесты Cholsterol-C, Phospholipid-В и Triglyceride-G, Wako Pure Chemical Co, Осака, Япония).

Получение общих липидов

Экстракция общих липидов из эритроцитов была произведена сразу же после получения отмытых эритроцитов [8,23,24]. 500 мкл уплотненных эритроцитов подвергли гемолизу в равном объеме воды. К лизату добавили 4 мл метанола, а затем через 40 минут 4 мл хлороформа. Еще через 30 мин экстракт был центрифугирован, а остаток повторно экстрагирован 4 мл смеси метанола и хлороформа (1:1). Объединенные экстракты были промыты 10 мл KCl 0,88% для получения двухфазной смеси. 2 мл нижней фазы высушили в потоке газообразного азота. Общие липиды из плазмы (500 мкл) были получены тем же способом, что и из эритроцитов. Метанол и хлороформ, использованные при экстракции липидов, содержали бутилгидрокситолуол (50 мг/л).

Разделение фосфолипидных классов

Разделение фосфолипидных классов, включая плазмалогены (Pls), было проведено по описанному нами методу [8]. Была использована система ВЭЖХ Agilent HPLC (HP-1100 Series, Agilent Technologies, Токио, Япония) с испарительным нефелометрическим детектором, флуоресцентным детектором и УФ-детектором. Система была подключена к рабочей станции Chem Station (Agilent Technology), которая использовалась для контроля и анализа хроматограмм. Относительное содержание фосфолипидных классов было измерено в каждой хроматографической области с помощью испарительного нефелометрического детектора.

Анализ жирнокислотного состава фосфолипидов

Данные о каждом фосфолипиде были получены ВЭЖХ с УФ-детектором [23,24]. Результаты анализа жирнокислотного состава фосфолипидов соответствовали наших предыдущим работам [23,24].

Анализ данных

Мы проанализировали данные с использованием парного (двустороннего) t-критерия с уровнем значимости р <0,05.

Конфликт интересов

Авторы заявляют, что у них отсутствует конфликт интересов.

Вклад каждого из авторов

СМ провел все эксперименты и подготовил рукопись статьи. ТК принял участие в критическом обсуждении результатов. КМ получил очищенные плазмалогены. ТФ спланировал исследование и участвовал в критическом обсуждении результатов. Все авторы прочитали и одобрили окончательный вариант рукописи.

Благодарности

Это исследование было проведено благодаря частичному финансированию Национальной исследовательской организации Японии в области сельского хозяйства и питания.

Сведения об авторах

Институт реологической функции питания, 2241 Kubara, Hisayama-chou, Kasuya-gun, Fukuoka 811-2501, Japan.

Кафедра интегративной физиологии, Высшая школа медицинских наук Университета Кюсю, Fukuoka 812-8582, Japan.

Центральный исследовательский институт, Marudai Food Co. Ltd, Osaka, Japan.

Институт реологической функции питания, 2241 Kubara, Hisayama-chou, Kasuya-gun, Fukuoka 811-2501, Japan.

Получено: 5 сентября 2012 года
Принято: 18 ноября 2012 года
Опубликовано: 21 ноября 2012 года
doi:10.1186/1476-511X-11-161

Форма цитирования: Mawatari et al: Dietary plasmalogen increases erythrocyte membrane plasmalogen in rats. Lipids in Health and Disease 2012 11:161.

Данный текст охраняется законом РФ о защите авторских прав, а также международным законодательством в этой области.

Любое частичное или полное копирование и воспроизведение без разрешения владельца запрещено. Лица, виновные в нарушении авторских прав и исключительных прав на использование текста, несут гражданско-правовую, административную и уголовную ответственность"